Lowongan

Electrofocusing, or isoelectric focusing, is a technique for separating different molecules by their electric charge differences (if they have any charge). It is most commonly used on title="Protein">proteins.

It is a type of zone electrophoresis that takes advantage of the fact that a molecule's charge changes as the pH of its surroundings changes.

Molecules are distributed over a medium that has a pH gradient (usually created by aliphatic ampholytes). An electric current is passed through the medium, creating a "positive" and "negative" end. Negatively charged particles migrate through the pH gradient toward the "positive" end while positively charged particles move toward the "negative" end. As a particle moves into a pH that neutralizes its charge, it will stop following the current. Particles of the same initial charge will deposit (or focus) around the same place on the pH gradient.

Isoelectric focusing

Isoelectric focusing, IEF, (biasa disebut juga electrofocusing) adalah sebuah metode untuk memisahkan molekul-molekul yang mana karakteristik muatan mereka berbeda.

IEF untuk protein, diterapkan suatu lowongan medan listrik terhadap campuran protein yang diletakkan dalam tempat tertentu, dimana gradien PH stabil sebelumnya telah dihasilkan. Daerah Kutub positip (anoda) terletak pada PH yang lebih rendah dibandingkan daerah kutub negatif (katoda) dan jangkauan PH dipilih sedemikian hingga protein yang akan dipisahkan memiliki titik-titik lowongan isoelectric dalam jangkauan PH ini. Protein yang terletak dalam daerah PH yang lebih rendah daripada PL-nya akan dicatu muatan positif, sehingga mereka akan bermigrasi menuju daerah kutub negatif (katoda). Selama terjadi lowongan migrasi PH akan terus turun sampai protein mencapai PH yang sama dengan PL-nya. Pada keadaan ini, tidak terdapat muatan bersih sehingga proses migrasi akan berhenti. Suatu protein [yang] yang mana [adalah] di (dalam) suatu pH daerah di bawah pI nya akan [jadi] bermuatan positif lowongan dan demikian akan berpindah tempat ke arah katode [itu]. Bagaimanapun, [seperti/ketika] [itu] berpindah tempat, sehingga pH akan ber/kurang sampai jangkauan protein [adalah] suatu pH [yang] yang mana [adalah] pI nya. Dalam posisi ini [itu] tidak punya [beban/ tugas] [netto/jaring] dan demikian migrasi berhenti. Perlukah [itu] melampaui ini menunjuk, [itu] akan masuk suatu daerah pH di atas pI nya dan demikian menjadi bermuatan negatif. [Itu] akan kemudian membalikkan arah migrasi nya dan sekarang berpindah tempat ke arah kutub positip [itu]. Oleh karena itu protein menjadi memusat ke dalam rombongan lowongan keperluan tajam/jelas dengan protein masing-masing memposisikan pada suatu titik di (dalam) pH yang gradien sesuai dengan pI nya. Teknik adalah mampu untuk resolusi sangat tinggi dengan protein yang berbeda oleh [beban/ tugas] tunggal menjadi fractionated ke dalam rombongan terpisah.

For IEF of proteins, the protein mixture is subjected to an electric field in an inert support in which a stable pH gradient has previously been generated. The anode region is at a lower pH than the cathode and the pH range is chosen such that the proteins to be separated have their isoelectric points within this range. A protein which is in a pH region below its pI will be positively charged and so will migrate towards the cathode. However, as it migrates, so the pH will decrease until the protein reaches a pH which is its pI. At this point it has no net charge and so migration ceases. Should it overshoot this point, it will enter a region of pH above its pI and so become negatively charged. It will then reverse its direction of migration and now migrate towards the anode. Therefore proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI. The technique is capable of extremely high resolution with proteins differing by a single charge being fractionated into separate bands.

Ph yang stabil yang gradien antar[a] electroda dibentuk dengan termasuk suatu campuran [dari;ttg] bobot molekular rendah ' pengangkut ampholytes' di (dalam) pen;dukungan yang tanpa daya [itu]. Ini adalah buatan, cuka polyaminopolycarboxylic alifatik yang tersedia secara komersial pI individu siapa menilai tutup [adalah] suatu pH cakupan preselected. [Dengan] begitu seseorang dapat membeli lowongan pengangkut ampholytes memutar yang manapun lowongan lowongan suatu pH cakupan lebar/luas ( e.g. pH 3- 10) atau suatu cakupan sempit ( e.g. pH 7- 8). komersil Ampholytes meliputi Ampholine, Biolyte Dan Pharmalyte.

The stable pH gradient between the electrodes is formed by including a mixture of low molecular weight 'carrier ampholytes' in the inert support. These are synthetic, aliphatic polyaminopolycarboxylic acids available commercially whose individual pI values cover a preselected pH range. Thus one can purchase carrier ampholytes spanning either a wide pH range (e.g. pH 3 - 10) or a narrow range (e.g. pH 7 - 8). Commercial ampholytes include Ampholine, BioLyte and Pharmalyte.

Format yang tepat untuk IEF tergantung pada sifat alami pen;dukungan yang tanpa daya [yang] yang mana [adalah] digunakan. Awal aplikasi IEF menggunakan kolom gelas/kaca vertikal water-cooled mengisi dengan pengangkut ampholytes di (dalam) suatu sucrose kepadatan gradien lowongan. Sucrose Kepadatan yang gradien adalah pen;dukungan yang tanpa daya, kepadatan yang gradien membantu untuk menstabilkan kolom cairan [itu] melawan terhadap convective yang mencampur dalam kaitan dengan panas menghasilkan electrophoresis. Electroda yang bagian atas ( Kutub positip) telah dihubungkan untuk suatu reservoir cuka ( e.g. asam fosfat) dan electroda yang lebih rendah [bagi/kepada] suatu reservoir [yang] berisi suatu solusi bersifat alkali ( e.g. Naoh). Setelah masa electrophoresis untuk menetapkan pH [itu] gradien, contoh protein telah diperkenalkan ke dalam kolom dan electrophoresis melanjut sampai lowongan protein yang yang telah mencapai pI's mereka. Protein yang individu Rombongan kemudian adalah yang disembuhkan dengan pengairan kolom [itu] dari dasar nya ke dalam satu rangkaian pecahan. Prosedur ini masih digunakan untuk beberapa aplikasi PREPARATIVE IEF walaupun [itu] tidaklah lowongan tersebar luas dalam kaitan dengan yang mahal untuk [itu] ampholytes menggunakan. PREPARATIVE IEF dapat juga dilaksanakan pada [atas] suatu sedikit banyak(nya) skala lebih kecil ( tetapi namun mampu untuk memproduksi sejumlah miligram [dari;ttg] protein murni) penggunaan tempat tidur/alas [yang] flat/kempes horisontal suatu acuan/matriks embun/manik-manik 'gel' agar-agar, seperti Sephadex, di (dalam) palung gelas/kaca didinginkan. Setelah electrophoresis 'gel' agar-agar dibagi lagi ke dalam lowongan pecahan dari yang mana protein dapat eluted dengan penyangga/bantalan.

The exact format for IEF depends on the nature of the inert support which is used. Early applications of IEF used water-cooled vertical glass columns filled with carrier ampholytes in a sucrose density gradient. The sucrose density gradient was the inert support, the density gradient helping to stabilize the liquid column against convective mixing due to heat generated during electrophoresis. The upper electrode (anode) was connected to a reservoir of acid (e.g. phosphoric acid) and the lower electrode to a reservoir containing an alkaline solution (e.g. NaOH). After a period of electrophoresis to establish the pH gradient, the protein sample was introduced into the column and electrophoresis continued until the proteins had reached their pI's. The individual protein bands were then recovered by draining the column from its base into a series of fractions. This procedure is still used for some applications of preparative IEF although it is not widespread due to the high cost of the ampholytes used. Preparative IEF can also be carried out on a somewhat smaller scale (but still capable of producing milligram amounts of pure proteins) using horizontal flat beds of a gel bead matrix, such as Sephadex, in cooled glass troughs. After electrophoresis the gel is subdivided into fractions from which the proteins can be eluted with buffer.

Di samping di atas preparative pendekatan, IEF sebagian besar digunakan sebagai suatu teknik analitis untuk menilai kemurnian atau kompleksitas contoh protein [itu]. [Seperti/Ketika] dengan SDS-PAGE, bagaimanapun, jika jumlah protein memerlukan format murni hanya [order/ pesanan] beberapa lowongan micrograms, bahkan skala analitis electrofocusing mungkin (adalah) cukup untuk siap[kan itu. IEF Analitis dilaksanakan yang manapun polyacrylamide 'gel' agar-agar tangkai vertikal ( [yang] terutama [sebagai/ketika] first-dimensional separasi two-dimensional 'gel' agar-agar electrophoresis) atau di (dalam) polyacrylamide horisontal atau agarose 'gel' lowongan agar-agar papan.

Despite the above preparative approaches, IEF is mainly used as an analytical technique to assess the complexity or purity of protein samples. As with SDS-PAGE, however, if the amount of protein required in pure form is only of the order of a few micrograms, even analytical scale electrofocusing may be sufficient to prepare it. Analytical IEF is carried out either in vertical polyacrylamide rod gels (especially as the first-dimensional separation of two-dimensional gel electrophoresis) or in horizontal polyacrylamide or agarose slab gels.

Gel' agar-agar Papan horisontal IEF kini paling secara luas format digunakan untuk electrofocusing. Lembar;Seprai polyacrylamide [yang] tipis/encer atau agarose 'gel' agar-agar menjulang pada [atas] gelas/kaca atau plat plastik dan berisi pengangkut ampholytes pilih untuk memberi pH cakupan yang benar lowongan dapat dibeli atau disiapkan laboratorium [itu]. Adalah penting untuk menghindari molekular sieving efek sedemikian sehingga separasi protein terjadi semata-mata atas dasar [beban/ tugas]. Karenanya agarose 'gel' agar-agar akan di/terpilih pilihan ke polyacrylamide 'gel' agar-agar untuk lowongan separasi [dari;ttg] protein lebih besar oleh karena ukuran pori-pori lebih besar mereka. Jika polyacrylamide 'gel' agar-agar digunakan, konsentrasi 'gel' agar-agar di/terpilih agar supaya memberi suatu 'gel' agar-agar pori-pori besar dan demikian memperkecil sieving molekular. Ketebalan 'Gel' agar-agar 1- 2 mm dapat digunakan tetapi terus meningkat ultra-thin 'gel' agar-agar hanya 0.1- 0.25 mm yang tebal digunakan [karena;sejak] ini adalah lebih lowongan murah ( pengangkut ampholytes adalah mahal) dan mengijinkan lari/menjalankan lebih pendek waktu ( [karena;sejak] voltase [yang] lebih tinggi dapat digunakan) dan ditingkatkan resolusi.

Horizontal slab gel IEF is now the most widely used format for electrofocusing. Thin sheets of polyacrylamide or agarose gel mounted on glass or plastic plates and containing carrier ampholytes chosen to give the correct pH range can be purchased or prepared in the laboratory. It is important to avoid molecular sieving effects so that the protein separation occurs solely on the basis of charge. Hence agarose gels would be chosen in preference to polyacrylamide gels for the separation of larger proteins because of their larger pore size. If polyacrylamide gel is used, the gel concentration is chosen so as to give a large pore gel and so minimize molecular sieving. Gel thicknesses of 1 - 2 mm can be used but increasingly ultra-thin gels only 0.1 - 0.25 mm thick are being used since these are cheaper (carrier ampholytes are expensive) and allow shorter running times (since higher voltages can be used) and improved resolution.

Gel' agar-agar yang horisontal pada [atas] lembar;seprai plastik atau gelas/kaca mereka diatur pada [atas] plat water-cooled karena ini mengijinkan panas [itu] yang dihasilkan oleh electrophoresis untuk;menjadi siap diusir dan demikian menghindari penyimpangan memisahkan rombongan protein. [Seperti/Ketika] dengan polyacrylamide 'gel' agar-agar papan vertikal, berbagai lowongan contoh dapat diteliti berdampingan. Hanya sedikit micrograms protein diperlukan untuk analisa. Suatu prosedur sederhana untuk [mengisi/memuat] contoh [itu] ke 'gel' agar-agar adalah untuk mencelupkan suatu potongan catatan/kertas saringan [yang] kecil ke dalam contoh dan lowongan kemudian meletakkan permukaan 'gel' agar-agar pada [atas] ini di asal [itu]. Suatu jangka pendek electrophoresis sekarang mengijinkan protein [itu] untuk masuk 'gel' agar-agar [itu], catatan/kertas lowongan saringan dipindahkan dan electrophoresis dilanjutkan untuk beberapa jam untuk mengijinkan IEF untuk terjadi. Profil [dari;ttg] protein dipisahkan dapat dikhayalkan setelah electrophoresis dengan perbaikan dan noda rombongan protein [itu].

The horizontal gels on their glass or plastic sheets are arranged on water-cooled plates since this allows the heat generated by electrophoresis to be readily dissipated and so avoid distortion of the separating protein bands. As with vertical polyacrylamide slab gels, multiple samples can be analysed side by side. Only a few micrograms of proteins are required for analysis. A simple procedure to load the samples onto the gel is to dip a small piece of filter paper into the sample and then lay this on the gel surface at the origin. A short period of electrophoresis now allows the proteins to enter the gel, the filter paper is removed and electrophoresis is continued for several hours to allow IEF to occur. The profile of separated proteins can be visualized after electrophoresis by fixing and staining the protein bands.

Tidak sama dengan SDS-PAGE, IEF tidak memberi apapun informasi tentang bobot molekular yang dipisahkan polypeptides karena separasi terjadi atas dasar [beban/ tugas] sendiri. Bagaimanapun, dengan mengukur pH [itu] yang gradien lowongan ke seberang 'gel' agar-agar setelah electrophoresis menggunakan suatu electroda permukaan dan merekam posisi protein yang dipisahkan menarik perhatian, seseorang dapat menaksir pI [dari;ttg] protein ini; lowongan informasi yang bisa jadilah perencanaan tidak ternilai manapun besar-besaran ion-exchange chromatography masuk suatu rencana pemurnian.

Unlike SDS-PAGE, IEF gives no information about the molecular weight of the separated polypeptides since separation occurs on the basis of charge alone. However, by measuring the pH gradient across the gel after electrophoresis using a surface electrode and recording the position of the separated protein of interest, one can estimate the pI of this protein; information which could be invaluable in planning any large-scale ion-exchange chromatography step in a purification scheme.

Jangan Lupa Share Artikel Ini Ya...?
Bagikan artikel ini ke temanmu melalui "SosMed" kamu di bawah ini: